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蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法有哪些?

更新時(shí)間:2023-10-12點(diǎn)擊次數(shù):1374

蛋白質(zhì)含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)可以用于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度和檢測(cè)所提取的蛋白質(zhì)含量,那么蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法有哪些呢?讓我們一起來看看吧!

一、folin—酚試劑法

這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是zui靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用zui廣泛的一種方法,由于其試劑的配制較為困難,近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即folin-酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是:在堿性條件下,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產(chǎn)生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比。

folin-酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高,比雙縮脲法靈敏得多,缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長,要精確控制操作時(shí)間,標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式,且專一性較差,干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子,同樣容易干擾lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素(0.5%),硫酸納(1%),硝酸納(1%),三氯yi酸(0.5%),乙醇(5%),yi醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液對(duì)顯色無影響,但這些物質(zhì)濃度高時(shí),必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液,只須加濃碳酸鈉-氫氧化鈉溶液,即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高,顯色后會(huì)色淺,則必須提高碳酸鈉-氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。

二、考馬斯亮藍(lán)法

考馬斯亮藍(lán)顯色法的基本原理是根據(jù)蛋白質(zhì)可與考馬斯亮藍(lán)G-250 定量結(jié)合。當(dāng)考馬斯亮藍(lán) G-250 與蛋白質(zhì)結(jié)合后,其對(duì)可見光的最大吸收峰從 465nm 變?yōu)?595nm。在考馬斯亮藍(lán) G-250 過量且濃度恒定的情況下,當(dāng)溶液中的蛋白質(zhì)濃度不同時(shí),就會(huì)有不同量的考馬斯亮藍(lán) G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉(zhuǎn)變成吸收峰為 595nm 的形式,而且這種轉(zhuǎn)變有一定的數(shù)量關(guān)系。一般情況,當(dāng)溶液中的蛋白質(zhì)濃度增加時(shí),顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加,因此可以用考馬斯亮藍(lán) G-250 顯色法來測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的含量。

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